Zusammenfassung
5′/3′-RACE-PCR
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Rapid Amplification of cDNA Ends
FormalPara Englischer Begriff5′/3′-RACE-PCR; rapid amplification of cDNA ends
FormalPara DefinitionRACE-PCR ist eine Sonderform der PCR zur „Rapid Amplification of cDNA Ends“, die eingesetzt wird, um bei unbekannten, oftmals unvollständigen mRNA-Transkripten bzw. cDNAs das fehlende 5′- aber auch 3′-Ende zu identifizieren.
FormalPara BeschreibungBei der 5′-RACE-PCR geht man von der bekannten Teilsequenz der cDNA aus und synthetisiert einen Antisense-Primer, den man in eine unidirektionale PCR (Polymerase-Kettenreaktion) mit der cDNA einsetzt, um das 5′-Ende als DNA-Strang zu synthetisieren. Durch Einsatz des Enzyms TdT („terminale deoxynucleotidyl transferase“) und entsprechenden Nukleotiden wird dem 5′-Ende ein Homopolymer-Ende, z. B. Poly(G), angefügt. Im nächste Schritt wird eine PCR-Reaktion mit einem Antisense-Primer, der in der bekannten cDNA-Sequenz etwas weiter in 5′-Richtung liegt, und einem Sense-Primer (sog. Adaptor-Primer) durchgeführt, der dem Poly(G)-Tail des neu synthetisierten 5′-Endes reziprok ist, d. h. poly(C) enthält. Das nun in großer Zahl vermehrte 5′-Ende kann nun entweder kloniert oder direkt sequenziert werden.
Die 3′-RACE-PCR läuft ähnlich, lediglich, dass man Sense-Primer für die bekannte cDNA-Sequenz einsetzt und als Homopolymer am 3′-Ende direkt auf den Poly(A)-Schwanz des Transkripts zurückgreifen kann und einen Poly(T)-Antisense-Primer (Adaptor-Primer) für die PCR-Reaktion einsetzt.
Literatur
Frohman MA et al (1988) Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer. Proc Natl Acad Sci USA 85:8998–9002
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Arnemann, J. (2018). 5′/3′-RACE-PCR. In: Gressner, A., Arndt, T. (eds) Lexikon der Medizinischen Laboratoriumsdiagnostik. Springer Reference Medizin. Springer, Berlin, Heidelberg. https://doi.org/10.1007/978-3-662-49054-9_3637-1
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