Übertragung der genetischen Information für Stickstoffbindung aus E. coli auf Bodenbakterien aus der Rhizosphäre von Gräsern mit Hilfe von Plasmiden

Summary

Cells of the non nitrogen fixing, drug sensitive enterobacterium, Enterobacter cloacae, which had been isolated from the rhizosphere of Festuca heterophylla, were mated toEscherichia coli harboring plasmid pRDl. This plasmid carries the nitrogen fixation genes (nif⁺) as well as three drug resistance markers. After mating, triple resistant Enterobacter lines were selected. These were screened for plasmid content, acetylene reduction and stability of the transferred markers.

Primary transférants contained plasmid pRDl. 43 out of 48 were acetylene reducing and therefore contained the nif gene group. Triple resistance was stable after many generations in liquid minimal media, but the number of nif⁺ cells decreased. In complete medium, both the triple resistance and nif⁺ phenotypes decreased, the rate of change depending on the isolate. The most stable isolate, M14, was chosen and checked further. Cultures taken after 8–14 transfers into minimal media contained cells with different genotypes, which on analysis had different plasmid sizes from the original pRDl. In addition cells without free plasmids were present. Progeny of the latter cells, in addition to being triple resistant, were the best acetylene reducers. It is concluded, that in these cells plasmid pRDl with all relevant genes had become integrated into the recipients’ chromosome.

Seedlings of Festuca heterophylla were inoculated with the latter bacteria, planted into pots with sterile volcanic ash and watered with nutrient solution of low nitrogen content. Sampling after five weeks and 12 weeks showed that the inoculated bacteria were preserved, as demonstrated by their triple resistance and their capability to reduce acetylene.

Zusammenfassung

Zellen eines nicht stickstoffixierenden, antibiotikasensiblenEnterobacter cloacae, die aus der Rhizosphäre von Festuca heterophylla stammten, wurden mit Escherichia coli-Zellen gemischt, die das Plasmid pRDl enthielten. Dieses Plasmid trägt die Gene für Stickstoffixierung (nif⁺) sowie drei Marken für Antibiotikaresistenz. Aus solchen Ansätzen konnten tripelresistente Enterobacterlinien selektioniert werden. Diese wurden hinsichtlich Plasmidgehalt, Azetylenreduktion und Stabilität der transferierten Marken geprüft.

Primäre Transferanten enthielten das Plasmid pRDl. 43 von 48 reduzierten Azetylen, d. h. enthielten die nif-Gene. Die Tripehesistenz war über viele Generationen in flüssigem Minimalmedium stabil, während der relative Anteil der nif⁺-Zellen hier abnahm. In Vollmedium nahm auch die Tripelresistenz ab, jedoch unterschiedlich rasch für verschiedene Isolate.

Das stabilste Isolât, M14, wurde weiter analysiert. Jene Kulturen des Isolats, die nach 8–14maliger Passagierung in Minimalmedium gewonnen worden waren, enthielten Zellen mit unterschiedlichem Genotyp. Einige hatten noch Plasmide, diese waren aber kleiner als das Spenderplasmid. Andere hatten keine freien Plasmide mehr. Die letzteren waren aber noch tripelresistent und reduzierten auch Azetylen noch in starkem Maße. Es wird geschlossen, daß diese Zellen das Spenderplasmid mit allen relevanten Genen fest ins Chromosom integriert tragen.

Keimlinge von Festuca heterophylla wurden mit solchen Bakterien beimpft, in Töpfe mit sterilem Bimsmaterial eingepflanzt und mit N-armer Nährsalzlösung gegossen. Probenentnahmen nach bis zu 12 Wochen zeigten, daß die eingeimpften Bakterien im Wurzelbereich des Grases erhalten bleiben. Sowohl die Tripelresistenz als auch die Fähigkeit zur Azetylenreduktion sind nach diesem Zeitraum noch vorhanden.

Mit Unterstützung der Deutschen Forschungsgemeinschaft.