Etablierung von Zellkulturmodellen des Rinderund Schafcolonepithels

Zusammenfassung

Epithelzellen des Rinder- und Schafcolons konnten mit einer Kombination aus mechanischer Präparation und enzymatischem Aufschluß aus dem Gewebe frisch geschlachteter Tiere isoliert werden. Isolierte Einzelzellen, die hauptsächlich Fibroblasten darstellten, konnten über einen 2%igen D-Sorbitol Gradienten von den Darmkrypten abgetrennt werden. Auf diese Weise wurde eine Kontamination mit Fibroblasten verhindert. Die Darmkrypten wurden in collagenbeschichtete Kulturgefäße ausgesät.

Unter den gewählten Kulturbedingungen konnten die Epithelzellen für 8-10 Tage kultiviert werden, wobei die Zellen des Rindercolonepithels passagiert werden konnten. Die Zellen wurden während der Kultivierungsdauer morphologisch und enzymatisch charakterisiert. Für die Rindercolonzellen wurde eine Verdopplungszeit von 21 Stunden ermittelt, für die Schafcolonzellen eine Verdopplungszeit von 15 Stunden. Mit Hilfe von Antikörpermarkierungen mit Anti-Cytokeratmen 7 und 13-Antikörpern wurde der epitheliale Ursprung beider Zellkulturen nachgewiesen. Antikörpermarkierung mit Anti-Vimentin- Antikörpern dienten als Negativ-Kontrolle. Die Erhaltung der sekretorischen Funktion der Zellen während der Kultivierungsdauer konnte mit der Alcianblau-PAS-Färbung nachgewiesen werden. Am Beispiel der Enzyme saure Phosphatase und NADH-Dehydrogenase wurde eine stabile Expression von Enzymaktivitäten über einen Kulturzeitraum von 6 Tagen nachgewiesen.

Beide Kultursysteme von Colonepithelzellen des Rindes und des Schafs werden weiter hinsichtlich ihrer Morphologie sowie ihrer fremdstoffmetabolisierenden Kapazität untersucht. Hierbei sollen vor allem die Aktivität der Enzyme der Phase I und Phase II des Fremdstoffmetabolismus während der Kultivierung im Vergleich zu in vivo untersucht werden. Nach dieser eingehenden Charakterisierung sollen diese Zellkulturen als Modellsystem für in vitro-Untersuchungen zur Colon Kanzerogenese verwendet werden.

Summary

By a combination of a mechanic preparation and an enzymatic digestion colon epithelial cells were isolated from samples of freshly slaughtered cattles and sheeps.

Single cells, mostly fibroblasts, were separated from intestinal crypts by a 2% D-sorbitol gradient centrifugation to prevent a contamination with fibroblast. The crypts were seeded in collagen I-coated culture vessels and cultured for 8-10 days under the chosen culture conditions. Bovine epithelial cells could be subcultivated during this period. Düring the culture period the cells were examined with regard to their morphology and enzymatic activities. A population doubling time of 21 hours for the cultured bovine cells and 15 hours for the cultured ovine cells were calculated. By antibody labelling with anti-Cytokeratin 7 and 13 antibodies the epithelial origin of both cell cultures was proved. The preservation of the secretory function of bovine epithelial cells was shown by alcian blue-PAS staining. Stable expression of enzyme activities during the culture period was demonstrated by measuring activities of acid phosphatase and NADH-dehydrogenase. Both culture systems have to be examined further with regard to their ultrastructure as well as their capacity for metabolizing xenobiotics. Here the activity of phase I and II enzymes during the culture period should be compared with the activities in situ. After this thorough characterization these cell systems should serve as useful in vitro tool for studies on colon cancerogenesis.