Mutual influence on collagen synthesis and proliferation by TGF-β₁ and PDGF-A/B in arterial smooth muscle cells

Abstract

Atherogenesis is characterized by an increased proliferation of arterial smooth muscle cells (SMCs) and extensive deposition of extracellular matrix proteins, especially collagens. These pathological events may be a consequence of modulated SMC behavior, possibly induced by an imbalance of synergistically acting growth factors, which are released from platelets, T-lymphocytes and monocytes/macrophages.

We examined synergistic effects of PDGF-A/B and TGF-β₁ on protein synthesis, collagen production and proliferation capacity in enzymatically isolated SMCs from the aortic media of young swine. Proliferation of subconfluent growing SMCs was determined by [³H]-thymidine uptake, cell counting and cell cycle determinations. To measure DNA synthesis, SMCs were incubated for 24 h with 5 ng/ml PDGF-A/B together with various TGF-β₁ concentrations (0.01 ng/ml up to 1 ng/ml) in medium containing 0,5% serum and 1 µCi/ml [³H]-thymidine. Samples were determined as TCA insoluble products in a liquid scintillation counter. To measure cell replication, SMCs were incubated with growth factors for 48 h without radioactive labeling and the cells were counted with a Schärfe cell counting system CASY 1. Cell cycle determinations of propidium iodide labeled nuclei were performed with a FACScan after an incubation period with growth factors of 24 h. TGF-β₁ downregulates in a dose-dependent manner the PDGFA/B induced increase of SMC proliferation, yielding a maximal 2.9-fold inhibition of DNA synthesis corresponding to a reduction of cells being in S-phase from 23.3% to 9.5% and a reduction of the cell numbers to an amount found in controls.

To measure protein/collagen synthesis, SMCs were cultured as confluent monolayers and preincubated for 24 h with 5 ng/ml PDGF-A/B in combination with 1 ng/ml TGF--β₁ in medium containing 1% serum. Cells were further incubated with growth factors for 24 h in the presence of [¹⁴C]-proline. For RNA preparation, cells were isolated after the preincubation period. TGF-ß₁ induced a 1.8-fold increase in total proteins produced, and in addition a specific 1.9-fold enhancement in the proportion of collagen from 10% to 19%. The corresponding level of collagen type I mRNA was also found being 1.8-fold increased by TGFß₁. PDGF-A/B alone had no influence on the increased synthesis of total proteins however in combination with TGF-0₁, the specifically enhanced collagen proportion and mRNA value was reduced to those presented by control cells. We conclude from these results that PDGF-A/B and TGF-f3₁ exhibit mutual interactions for controlling and regulating proliferation and collagen synthesis of SMCs.

Zusammenfassung

Die Atherogenese ist im wesentlichen durch eine stark erhöhte Proliferation glatter Muskelzellen und eine extensive, hauptsächlich aus Kollagenen bestehende Produktion extrazellulärer Matrixproteine gekennzeichnet [16, 19]. Diese pathologischen Veränderungen scheinen aus einem, potentiell reversiblen, modulierbaren Verhalten der glatten Muskelzellen zu resultieren. Wachstumsfaktoren, die ein breites Spektrum biologischer Aktivitäten auf Zellen ausüben und von Thrombozyten, T-Lymphozyten oder Monozyten/Makrophagen sezerniert werden können, mag daher eine Rolle bei der Entstehung derartiger Ereignisse zuzuschreiben sein. Die Charakteristika und Mechanismen solcher, zum Teil synergistisch und interagierend wirkender, mitogener Faktoren sind bis heute noch weitgehend unbekannt und bedürfen einer detaillierten Aufklärung. Innerhalb einer Vielzahl von Faktoren haben Platelet Derived Growth Factors (PDGF) und Transforming Growth Factors (TGF) in letzter Zeit große Aufmerksamkeit erfahren, da sie das Zellverhalten mesenchymaler Zellen entscheidend beeinflussen können. Platelet Derived Growth Factor ist ein aus zwei verschiedenen Polypeptidketten (A- und B-Ketten) zusammengesetztes, 30 kDa schweres Protein und kann bei Zellen, die einen geeigneten Rezeptor für diesen Faktor besitzen, eine Erhöhung der metabolischen, chemotaktischen oder proliferativen Aktivität induzieren [18]. Transforming Growth Faktor-ß, ist ein homodimäres Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 25 kDa und beeinflußt Zelldifferenzierungsprozesse in einem ebenso hohem Maße wie PDGF. So sind für TGF-β, wachstumsregulierende und matrixsynthesemodulierende Einflüsse beschrieben worden [20]. Wachstumsfaktoren scheinen daher auch in einem nicht unerheblichen Maße an der Pathogenese der Arteriosklerose mitbeteiligt zu sein. Es ist jedoch eher unwahrscheinlich, daß die Regulation zellulärer Differenzierungsprozesse dem Einfluß nur eines Signalmoleküles unterliegt, da für TGF-ß und Epidermal Growth Factor (EGF) oder PDGF und TGF-ß kürzlich Interaktionen und Synergismen in bezug auf ihre chemotaktische, migrations- und proliferationsfördernde Wirkung publiziert worden sind [1, 12, 15]. Diese Ergebnisse legen den Schluß nahe, daß für die Regulation ein ausbalanciertes, komplexes Zusammenspiel mehrerer, gleichzeitig vorhandener Faktoren entscheidend ist. Aus diesem Grunde erschien es uns sinnvoll, den Einfluß von kombinierter TGF-13₁- und PDGF-A/B-Gabe auf

• 1. die Protein- und Kollagensynthese und

• 2. auf die Desoxyribonukleinsäure(DNA)-Synthese und Zellteilungsfähigkeit kultivierter glatter Muskelzellen zu untersuchen.