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Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

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Der Experimentator Molekularbiologie/Genomics

Part of the book series: Der Experimentator ((EXPERIMENTATOR))

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Zusammenfassung

Eigentlich gehört die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in das Kapitel 3, doch ist sie momentan sicherlich die Methode der Molekularbiologie und wird es auch noch auf absehbare Zeit bleiben. Grund genug, ihr ein eigenes Kapitel zu widmen.

Das Prinzip ist herrlich einfach und nachträglich fragt man sich, weshalb die Methode nicht schon viel früher erfunden wurde. Die Antwort lautet vielleicht, dassman vorher nicht gewusst hätte, was man damit anfangen soll. Denn seit den Anfängen 1985 (Saiki et al.) entdecken findige Köpfe permanent neue Anwendungen. Noch aus einem anderen Grund ist die PCR sich allgemeiner Aufmerksamkeit gewiss: Sie ist ziemlich rasch zum Übungsfall für die Wirtschaft geworden. Nie zuvor hat ein Patent in der Molekularbiologie so große Diskussionen ausgelöst, ging es doch um den Eingriff des Patentrechts in die Freiheit der Forschung. Die Gemüter haben sich inzwischen beruhigt, weil das Patent, solange es gültig war, die Enzymeinkäufe zwar etwas verteuert hat, aber sonst alles beim Alten blieb.

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Notes

  1. 1.

    So zumindest hat man es damals dargestellt. Tatsache ist, dass viele die eher schlechten Gehälter in der universitären Forschung gerne kompensieren, indem sie sich für etwas Besseres halten. Und wieso sollten sich die Guten an Patente halten müssen – insbesondere wenn diese in den Händen der Bösen liegen?

  2. 2.

    Das Patent für die native Taq-Polymerase wurde 2001 für ungültig erklärt, das Patent für die PCR-Technologie lief 2005 aus.

  3. 3.

    Stellvertretend seien hier nur die Online-Dienste von Thermo Scientific (http://www.finnzymes.fi/tm_determination.html) und NEB (http://www.neb.com/nebecomm/web_tools.asp, siehe Tm Calculator) genannt.

  4. 4.

    J = Konzentration monovalenter Kationen in Mol/l, % G + C = Anteil der Basen Guanin und Cytosin in Prozent, n = Anzahl der Basen im Oligonucleotid, % mismatch = Anteil der fehlgepaarten Basen in Prozent, % F A = Anteil des Formamids im Puffer in Prozent (entfällt normalerweise bei der PCR).

  5. 5.

    10 pmol Primer reichen aus für die Synthese von 6,6 µg eines 1 kb-Fragments.

  6. 6.

    Dieser Zusammenhang wurde mittlerweile von den Bioingenieuren erkannt und genutzt. So hat man eins Fusionsprotein gebastelt, das aus einer Archäen-Polymerase und einer DNA-bindenden Domäne besteht (Wang et al. 2004), wodurch die Prozessivität um Faktor 10 verbessert wurde, mit entsprechender Auswirkung auf die Polymerisationsgeschwindigkeit. Das Enzym wird unter dem Namen Phusion von NEB vertrieben.

  7. 7.

    Insbesondere Tth und Tfl.

  8. 8.

    Meist nach einer Umpufferung, denn die Reverse-Transkriptase-Aktivität ist Mn2+-, die normale DNA‐Polymeraseaktivität dagegen Mg2+-abhängig.

  9. 9.

    Selten geben die Hersteller eine Erklärung zum Funktionsmechanismus, daher will ich hier als ein besonderes Schmankerl die Funktionsweise des ArchaeMaxx® Enhancing Factor von Stratagene wiedergeben: Polymerasen mit Proofreading-Aktivität reagieren offenbar nicht sehr positiv auf dUTP, das während der PCR durch die Deaminierung von dCTP entstehen kann (Hogrefe et al. 2002). Der archaische Max verwandelt dUTP in dUMP und rettet so die Situation.

  10. 10.

    Die Firma besitzt das Patent auf diese Methode.

  11. 11.

    Später wurde die Methode dahingehend modifiziert, dass man am 3'-Ende nur noch eine „spezifische“ Base einsetzt (siehe Liang et al. 1994). Man reduziert dadurch die Zahl der Ansätze von 12 auf 3 und erhält auch noch weniger Schmier.

  12. 12.

    CT steht je nach Quelle für cycle threshold oder threshold cycle.

  13. 13.

    In der Praxis wählt man einen Fluoreszenzwert, bei dem sich alle Kurven noch im exponentiellen Bereich befinden, und ermittelt, nach wie vielen Zyklen die Kurven jeweils diesen Wert erreichen. Dieser Wert entspricht dem CT -Wert.

  14. 14.

    RAGE steht für Rapid Amplification of Genomic DNA Ends.

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Authors and Affiliations

  1. F. Hoffmann-La Roche AG, Grenzacherstr. 124, 4070, Basel, Schweiz

    Cornel Mülhardt

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  1. Cornel Mülhardt
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Mülhardt, C. (2013). Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). In: Der Experimentator Molekularbiologie/Genomics. Der Experimentator. Springer Spektrum, Berlin, Heidelberg. https://doi.org/10.1007/978-3-642-34636-1_4

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