Laboratory methods for detecting the toxins of Clostridium difficile

Summary

Clostridium difficile is the principal gut pathogen responsible for nosocomial diarrhea in the adult. This anaerobic organism is isolated in 10% of stool cultures received in hospital microbiology laboratories. Many methods and strategies have been devised for the diagnosis of C. difficile related infection. Among these, the detection of the toxins (which are directly implicated in the pathophysiology of the digestive problems caused by C. difficile) have been considered the best means of diagnosis. Current practice in this area has developed considerably over the last ten years.

The detection of toxin B by the stool cytotoxicity assay (SCA) is still considered today to be the standard method. Whatever cell line is used (CHO, HeP-2, MRC5, Yero), it provides good sensitivity (detecting levels of toxin B of the order of a picogram) and excellent specificity when the cytopathie effect is neutralized by a specific antiserum. However this technique suffers from several disadvantages including time (it takes 24–48 hours), lack of standardization, heavy demands on staff, and difficulty in obtaining the antiserum.

Identification of the toxins has recently been improved by the introduction of commercial immuno-enzymatie (ELISA) tests, which detect either toxin A alone or both A and B simultaneously. The specificity of these tests is excellent (> 97% as a rule) but their sensitivity varies from 52% to 99%. Results are available in less than three hours which may allow the time to begin necessary hygienic precautions, so as to limit the spread of infection of these organisms. These tests, in spite of their high unit costs, represent an excellent alternative for those bacteriology laboratories which lack the facilities required for cell culture.

More recently, cloning and gene sequencing of toxins A and B have opened the way for molecular biology techniques. Membrane hybridization of the stools with the aid of specific probes for toxin B, have shown a 96% correlation with the SCA. Polymerase chain reaction (PCR) has also been applied to the detection of the genes of toxins A and B directly from the stools. The sensitivity of this method is higher than the SCA, but it is more difficult to perform and the many polymerase inhibitors present in the stools may interfere with the PCR. To avoid these snags, a magnetic Immuno PCR assay (MIPA) has recently been introduced. It consists in capturing C. difficile with magnetic spheres coated with antibody, then separating them from the stools so as to amplify the toxin B gene by PCR. Methods of detection of C. difficile toxins A and B by molecular biology are at a very early stage, and their role in relation to the established tests remains to be defined.

Résumé

C. difficile est le principal entéropathogène bactérien responsable de diarrhées nosocomiales chez l’adulte. Ce microorganisme anaérobie est isolé dans 10 % des coprocultures reçues dans des laboratoires hospitaliers de microbiologie. De nombreuses méthodes et techniques ont été mises au point pour le diagnostic des infections dues à C. difficile. Parmi elles, la détection des toxines (qui sont impliquées directement dans la physiopathologie des troubles digestifs causés par C. difficile) est considérée comme le meilleur moyen de diagnostic. Dans ce domaine, la pratique de routine s’est considérablement développée depuis ces dix dernières années.

La détection de la toxine B par la recherche d’un effet cytopathogène sur un filtrat de selles est considérée aujourd’hui encore comme la méthode de référence (test de cytotoxicité). Quelle que soit la lignée cellulaire utilisée (CHO, HeP-2, MRC5, Yero), elle possède une bonne sensibilité (seuil de détection de la toxine B de l’ordre du picogramme), et une excellente spécificité quand l’effet cytopathogène est neutralisé par un antisérum spécifique. Cependant cette technique souffre de plusieurs inconvénients, notamment le délai de réalisation (24 à 48 heures), le manque de standardisation, la nécessité d’une lourde infrastructure et la difficulté pour obtenir les antisérums.

L’identification des toxines a récemment été améliorée par la commercialisation de tests immunoenzymatiques (de type ELISA), qui détectent soit la toxine A isolée, soit les deux toxines A et B simultanément, à l’aide d’anticorps monoclonaux. La spécificité de ces tests est excellente (> 97 % en règle générale), mais leur sensibilité varie de 52 à 99 %. Les résultats sont disponibles en moins de trois heures, ce qui permet un traitement spécifique précoce et l’instauration rapide de mesures d’hygiène indispensables pour limiter la transmission nosocomiale de cette bactérie. Ces tests, en dépit de leur coût unitaire élevé, représentent une excellente alternative pour les laboratoires de bactériologie dépourvus de l’infrastructure nécessaire à la culture cellulaire.

Plus récemment, le clonage et le séquençage des gènes des toxines A et B ont ouvert la voie des techniques de biologie moléculaire. L’hybridation à l’aide de sondes spécifiques de la toxine B, d’une suspension de selles déposée sur membrane a montré une corrélation de 96 % avec le test de cytotoxicité des selles. La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) a aussi été appliquée à la détection des gènes des toxines A et B, directement à partir des selles. La sensibilité de cette méthode est supérieure à celle du test de cytotoxicité des selles, mais elle est plus délicate à réaliser, et les nombreux inhibiteurs de la polymérase présents dans les selles peuvent interférer avec la PCR. Pour éviter ces écueils, une technique de PCR sensibilisée par procédé immuno-magnétique, a récemment été élaborée. Elle consiste en la capture de C. difficile par des sphères magnétiques recouvertes d’anticorps, qui sont ensuite séparées des selles pour permettre d’amplifier le gène de la toxine B par PCR. Les méthodes de détection des toxines A et B de C. difficile par biologie moléculaire en sont à un stade très précoce de leur développement, et leur rôle par rapport aux tests usuels de diagnostic devra, à l’avenir, être défini.

Zusammenfassung

Clostridium difficile ist das wichtigste intestinale Pathogen und ist verantwortlich für nosokomiale Diarrhöen beim Erwachsenen. Der anaerobe Mikroorganismus läßt sich aus 10% der in mikrobiologischen Labors von Krankenhäusern untersuchten Stuhlproben kultivieren. Für die Diagnostik C. difficile-assoziierter Infektionen wurden zahlreiche Methoden und Strategien entwickelt. Von diesen gilt der Nachweis der C. difficile -Toxine (die direkt an der Pathophysiologie von Verdauungsstörungen im Zusammenhang mit C. difficile beteiligt sind) als zuverlässigstes diagnostisches Werkzeug. Die gängige Praxis auf diesem Gebiet hat sich in den letzten zehn Jahren erheblich weiterentwickelt.

Der Nachweis von Toxin B mittels zytopathischer Effekte (CPE) von Stuhlfiltraten gilt heute noch als Standardmethode. Bei allen verwendeten Zellinien (CHO, HeP2, MRC5, Vero) bietet der Test eine gute Sensitivität (die Nachweisgrenze von Toxin B liegt im Picogrammbereich) und eine hervorragende Spezifität durch Neutralisation der zytopafhischen Effekte durch ein spezifisches Antiserum. Allerdings weist das Verfahren mehrere Nachteile auf, darunter den Zeitaufwand (Dauer 24–48 Stunden), die fehlende Standardisierung, die starke Belastung des Personals und Probleme bei der Beschaffung des Antiserums.

Der Nachweis der Toxine ist erleichtert, seit neuerdings immun-enzymatische (ELISA) Tests, die entweder nur Toxin A oder gleichzeitig Toxin A und B nachweisen, im Handel sind. Die Spezifität dieser Tests ist ausgezeichnet (in der Regel > 97%), allerdings schwankt ihre Sensitivität zwischen 52% und 99%. Die Ergebnisse liegen in weniger als drei Stunden vor, wodurch Zeit für hygienische Vorkehrungen gewonnen wird, um die Ausbreitung von Infektionen mit diesen Keimen zu verhüten. Die Tests stellen trotz ihrer hohen Kosten eine hervorragende Alternative für solche bakteriologische Labors dar, denen die für Zellkulturen erforderlichen Einrichtungen fehlen.