Nachweis und Charakterisierung von Clostridium perfringens mittels real-time-PCR

Zuszammenfassung:

Clostridium perfringens gehört zur Gruppe der gram-positiven, anaerob bzw. aerotolerant wachsenden Bakterien. Abhängig von der Fähigkeit der einzelnen C. perfringens Stämme, alpha-, beta-, epsilon und iota-Toxin zu bilden, erfolgt eine Einteilung in die Typen A bis E, wobei C. perfringens Typ A für den überwiegenden Teil der lebensmittelassoziierten menschlichen Erkrankungen verantwortlich ist. Ursache solcher Toxin-Infektionen ist das erst im Darm im Rahmen der Sporulation der mit den Lebensmitteln aufgenommenen vegetativen Zellen gebildete Enterotoxin (CpE). In der Regel muss sich der Erreger im Lebensmittel auf mehr als 10⁶ KbE/g Lebensmittel vermehren, damit beim Konsumenten eine Erkrankung ausgelöst wird (BVET, 2005; BfR, 2005). Da die derzeit vorhandenen kulturellen Nachweisverfahren keine Möglichkeit bieten, die gewonnenen Isolate einem bestimmten Toxintyp zuzuordnen, kann der Nachweis von C. perfringens in einem Lebensmittel nach gültiger Rechtslage lediglich als ein Hinweis auf eine mangelhafte Produktions- oder Verarbeitungtechnologie oder auf das Vorliegen einer lebensmittelbedingten Toxin-Infektion gewertet werden.

Zum Nachweis der Toxingene, die eine Einteilung von C. perfringens in die fünf verschiedene Toxintypen ermöglichen, wurden drei Duplex-real-time-PCR-Assays etabliert und die Einsatzmöglichkeiten in der Routinediagnostik getestet. Die Systeme sollen für einen schnellen Nachweis und eine rasche Differenzierung von C. perfringens sowie als Screening-System bei Verdacht auf eine lebensmittelbedingte Erkrankung genutzt werden.

Abstract:

Clostridium perfringens is a Gram-positive, anaerobic bacterium. The strains are classified into five types (type A to E), depending on the ability to produce alpha-, beta-, epsiloon and iota-toxin, but food-poisonings are mostly caused by C. perfringens type A isolates. Ingestion of contaminated food is followed by gastrointestinal disease, when enzyme-resistant C. perfringens enterotoxins (CpE) are set free during sporulation. In most cases the bacterium has to grow up to more than 10⁶ cfu/g food to cause a gastrointestinal disease (BVET, 2005; BfR, 2005). Cultural methods, normally used for the detection of C. perfringens, are not able to differentiate isolates into the five different toxin types. This is the reason, why the detection of C. perfringens in food under the present legal regulations can only used as an indication for inadequate production hygiene or a toxin-infection with contaminated food as source.

For the detection of the toxin genes to differentiate C. perfringens in five different toxin types, three duplex real-time-PCR assays for the routine diagnostic were developed and validated. The assays can be used for quick detection and easy classification of C. perfringens isolates and as a rapid screening-system in suspected cases of C. perfringens food-poisonings.