Quantification of viable cells of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in digester material after heat treatment by TaqMan® BIO-PCR

Abstract

With bacterial ring rot affected potato lots must be decontaminated under official control without causing a risk for the dissemination of the disease. Therefore, at the Bavarian State Research Center for Agriculture (LFL) in Freising a research project is conducted to investigate, which characteristics (temperature and retention period) during anaerobic digestion must be given to eliminate Clavibacter michiganensis sub-sp. sepedonicus. Most biogas plants are run at temperatures between 35 and 55°C. Hence, at first a method was developed to study and describe thermosensitivity of the organism in digester material in the relevant temperature range. For this purpose the streptomycin resistant mutant Cms 4053 strep (NCPPB collection, UK) was used. Viable organisms could be exactly quantified after being incubated for ten minutes at different temperatures by combining an enrichment step on growing medium supplemented with streptomycin with real-time PCR (ABI Prism 7000) using TaqMan® probes (TaqMan® BIO-PCR). It could be shown, that the number of colony forming units (cfu) linearily declines between 35 and 55°C with rising temperatures during equal incubation time periods. Every temperature increase of 8°C reduced the number of cfu by a log₁₀ unit.

Zusammenfassung

Eine Kartoffelpartie, welche mit Bakterieller Ringfäule befallen ist, muss unter behördlicher Aufsicht so entsorgt werden, dass davon kein Risiko für die Verbreitung der Krankheit ausgeht. Deshalb wird in einem Forschungsvorhaben an der Bayeri-schen Landesanstalt für Landwirtschaft (LfL) in Freising un-tersucht, welche Parameter (Temperatur und Verweildauer) im Biogasprozess vorherrschen müssen, um Clavibacter michi-ganensis subsp. sepedonicus sicher abzutöten. Die meisten Biogasanlagen werden bei einer Temperatur von 35 bis 55°C betrieben. Deshalb wurde zuerst ein Verfahren entwickelt, um die Temperatursensitivität des Erregers in Gärsubstrat in diesem Temperaturbereich untersuchen und beschreiben zu können. Dazu wurde die streptomycinresistente Mutante Cms 4053 strep (NCPPB collection, UK) verwendet. Die exakte Quantifizierung lebensfähiger Individuen nach zehnminüti-ger Inkubation bei verschiedenen Temperaturen gelang, indem ein Anreicherungsschritt auf streptomycinhaltigem Nährmedium mit der Realtime-PCR (ABI Prism 7000) unter Ver wendung vo n Taq Man®-Sonden kombiniert wurde (Taq-Man® BIO-PCR). Es konnte gezeigt werden, dass die Anzahl koloniebildender Einheiten (KBE) zwischen 35 und 55°C bei gleicher Inkubationsdauer mit steigender Temperatur linear abnimmt. Eine Temperaturerhöhung um 8°C bewirkte jeweils eine Reduzierung der KBE um eine Log₁₀-Einheit.